通常从人体活检中采集并保存福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本，用于组织学研究。福尔马林固定法通过将核酸和蛋白质的细胞内容物交联并将样品包裹在蜡中，使材料可在室温下保存多年。世界各地的生物中心和研究人员储存了数以百万计的FFPE样本。

随着文库准备和下一代测序技术的进步，这些样本中保存的核酸现在可以被恢复，以产生重要的基因组信息。因此，存档的FFPE样品成为了丰富而珍贵的研究材料来源。越来越多的研究实验室利用zinq FFPE样本来分析和了解与疾病相关的基因和突变多种因素导致了从FFPE分离出的DNA质量的变化，包括保存过程中发生的核酸化学变化，保存过程缺乏标准化，以及存档样本的年龄。从FFPE样本中分离出的DNA质量较低，有望产生低复杂度的NGS文库，因为尽管分离出的DNA有明显的浓度，但DNA的“可用”量很低为了创建具有最大多样性的库，选择正确的库准备方法是至关重要的。          ThruPLEX technoloqy使用茎环适配器，这样就不需要中间的清理步骤，维持单管工作流程，并保持库的复杂性。最后的扩增利用了所有修复和连接的分子，结果在文库中发现了大量的独特分子(Fiqure 1)。另一个好处是，创建文库的时间减少到大约两小时。ThruPLEX DNA-seq库也可以很容易地与其他应用程序集成，如目标富集。输入材料的高度多样性保证了捕获将产生文库的优良覆盖整个基因组的目标区域。

 图1.采用ThruPLEX技术。这个工作流程使用了一个三步单管反应，开始的片段双链DNA，经过一个高效的修复过程。接下来，茎环适配器被钝端连接到修复的输入DNA上。使用高保真聚合酶对这些分子进行扩展和扩增，使其包括条形码，从而生成索引化的Illumina NGS库。

在本技术说明中，我们演示了我们的通用文库准备试剂盒——ThruPLEX DNA-seg试剂盒与ffpe衍生的DNA一起使用时的性能和特点。对于非FFPE样本，标准方案建议的输入范围为0.05-50 ng，在此，我们将输入量增加到100 ng，以补偿FFPE样本中受损的DNA。我们的结果表明，在Ilumina平台上从ffpe提取的DNA中制备NGS文库时，      ThruPLEX DNA-seq技术是一个很好的选择。与其他库准备工具包相比，它提供了更多样化的库，同时最小化了GC偏差。我们进一步演示了ThruPLEX DNA-Seq试剂盒如何与Agilent SureSelect富集试剂盒成功集成，对FFPE样品进行靶向测序。

ThruPLEX DNA-seg技术生产的文库比NEB Next Ultra或KAPA Hyper试剂盒更具多样性。平均而言，ThruPLEX library产生的估算库大小比NEB Next Ultra大80%，比KAPA Hyper大240%，表明ThruPLEX library中存在更多的独特分子(图2)。正如预期的那样，ThruPLEX DNA-seq产生的重复读取不到2%。与NEBNext Ultra相似，而KAPA Hyper的重复reads范围最大(3-6%)(图2)。对文库分子插入量的检查显示，ThruPLEX DNA-Sea试剂盒产生的插入量为190 bp。大约相当于KAPA Hyper库，但比NEBNext Ultra的150-bp插入长约27%(图2)。在对配对端读取时，插入长度越长往往越有利，因为有更多的不重叠读取，可以更好地表示原始序列信息。

图2. 高度多样化的库。与其他测试试剂盒相比，ThruPLEX DNA-seq文库提供了更多独特的分子(上图)和更少的重复(上图)。下图:ThruPLEX DNA-seq创建的分子平均插入尺寸比NEB Next Ultra长-27%。比较了三种试剂盒制备的文库的GC覆盖率。ThruPLEX DNA-Seg试剂盒产生了最平衡的GC覆盖率(图3)。

图3. 均一的GC的覆盖度。由ffpe衍生的DNA制成的DNA序列分析文库覆盖了整个人类基因组。然后使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板对ThruPLEX DNA-seg文库进行富集。在每种情况下，库的质量都很高，如图4中的数据所示。通过测序深度测量的Kinome覆盖率与样本有关，并在目标面板覆盖40-50X的情况下进行测序。所有样品上饵覆盖率均大于70%

图4. 使用A gilent ClearSeq Human DNA Kinome面板丰富了ThruPLEX DNA-seq文库的目标测序指标。

FFPE样本的序列可能非常具有挑战性。在固定过程中引入的不同程度的化学损伤减少了可用于构建文库的“优质”材料的数量。为此，在这一系列实验中，我们修改了标准的ThruPLEX DNA seq协议，将输入量增加到100ng。这使我们能够创建更多样化的库(库复杂性高80-240%)，并且比其他库准备试剂盒包含更少的扩增。

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