Cholesterol plaque in blood vessel, 3D illustration

所以，推测产生的治疗作用可能是依赖于旁分泌机制产生的大量生物活性因子。大多数健康或疾病环境的细胞能够持续释放细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）进入周围环境，其中外泌体作为细胞间进行信息交流的重要工具有望替代干细胞移植。

MSC 来源的外泌体已进入临床试验阶段，主要针对急性缺血性脑中风、难治性黄斑孔裂、1 型糖尿病和阿尔茨海默症。因此，对外泌体的培养方法和相关参数、分离方法进行改进和优化，对其蛋白质和核酸进行严格分析均是其应用于临床的基础。

1983 年，Johnstone 等首次在绵羊网织红细胞中发现外泌体，但一直被认为是一种细胞废弃物。2010 年 MSC 来源外泌体首次在心肌缺血/再灌注损伤模型中被研究。研究表明，骨髓 MSC 比成肌细胞、人急性单细胞白血病细胞系（THP-1）、人胚胎肾细胞系（HEK）等能产生更多的外泌体。

体外培养人 MSC 外泌体的临床应用研究

MSC 来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多功能干细胞，其具有多向分化潜能、造血支持、免疫调控和自我复制等特点，是干细胞家族的重要成员，存在于骨髓、肝脏、脾脏、成人的骨骼肌、外周血、脂肪、韧带、胎盘、脐带、脐血、皮肤等组织中。2006 年国际间充质及组织干细胞委员会对人来源 MSC 实验研究提出 3 条最低鉴定标准：

①在标准培养条件下，MSC 必须具备对塑料底物的贴附特性；

②通过流式细胞仪检测，MSC 群体表达 CD105、CD73及 CD90 阳性率 ≥ 95%，且 CD45、CD34、CD14 或CD11b、CD79a 或 CD19、HLA-DR 的阴性表达率 ≥ 98%；

③在体外，通过标准方法诱导，MSC 必须能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。

临床试验中可能需要数百微克至毫克的外泌体来治疗患者，原代 MSC 数量很少，可以通过体外扩增培养，控制培养微环境来增加外泌体的产量和诱导有效成分的高表达。

目前常用的培养细胞产生 EVs 体系有 2D 培养体系、3D 培养体系（包括支架和无支架）和生物反应器。3D 培养体系可以弥补传统 2D 培养体系在生理模式方面的缺失，但 3D 培养体系其支架组成会影响 EVs 的数量和质量，且更难去评估，再现性和可伸缩性也应该被考虑，EVs的分离需要用酶进行消化，会影响 EV 的完整性和生物活性。生物反应器的优点在于 EV 的产量大，且在动态条件下培养，可以增强生物反应系统内的营养交换，但也必然会给 EV 的功能和特性带来影响，例如，细胞接种的密度、老化程度、增殖代数、分化的不同时期、培养基基质的形貌、刚性、流体剪切应力以及周期性拉伸等细胞培养微环境下的因素均会对 EV 产生影响。细胞接种密度过大，会产生接触抑制。

目前仍存在很多问题如外泌体提取的纯度和产量、治疗疾病的作用机理不明确以及携带的蛋白质、脂质、mRNA 和miRNA 是否会对人体产生其他危害等等。尽管有诸多限制条件,MSC-Ex 在疾病的治疗方面仍然具有广泛的研究价值和应用前景。

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