RNA-seq即转录组测序技术，就是把mRNA，smallRNA，and NONcoding RNA等或者其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出来。反映出它们的表达水平。

    RNA-seq是一种集合实验方法和计算机手段的一种技术，它可以确定生物样本中RNA序列的特征性和丰度，也就是说，存在于每条单链RNA分子中的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶核糖核酸残基的组成顺序，可以通过RNA测序被识别出来。RNA-seq中的实验方法涉及从细胞、组织或整个动物样本中分离RNA、不同RNA文库的构建、对文库进行化学法测序以及随后的生物信息学数据分析。同早期的技术方法相比，例如微阵列，一+个关键区别在于，当前RNA-seq平台惊人的高通量性和高的灵敏度，使得我们能够发现新的转录本、基因调控模型和更多非编码小RNA。

    转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。

    样品提取总RNA后，对于真核生物，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，对于原核生物，用试剂盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成cDNA第二链，经过试剂盒纯化并加 EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用Illumina HiSeq2000进行测序。

RNA测序流程包括：

    样本制备、建库：总RNA —> polyA富集mRNA —> 打断 —> 随机引物反转录成cDNA —> 末端修复、加A、加接头

一、RNA样本采集保存

1、血液RNA保存

    PAXgene® Blood RNA Tube采血管用于采血时细胞内RNA的快速稳定。内含保护剂采集后可以快速稳定细胞内RNA。室温稳定3天，4℃稳定5天。

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    RNAgard Blood Tubes采血管用于血液RNA和DNA的采集、保存和纯化。管内预装保护剂能快速渗透细胞膜裂解细胞，同时稳定RNA和DNA免于降解。室温能保存核酸达14天，4℃能保存1月。

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血浆游离RNA保存

    CELL-FREE RNA BCT® 采血管用于血浆游离RNA的采集、保存和运送。含有专利保护剂稳定血浆游离RNA，并能防止血液中其他背景RNA的释放。室温下游离RNA能稳定7天

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2、组织RNA保存

    RNALater稳定液是一种无毒的水溶性组织保存试剂，能够快速渗入组织内部，稳定并保护细胞RNA。在37°C、25°C和4°C下 RNA 分别可保持稳定1天、1周和1个月，-20°C下可长期稳定保存。

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二、RNA提取方法-使用试剂盒方法

    富集mRNA，除去rRNA等RNA:依据为-在测mRNA过程中，首先要去除rRNA。以人为例，在抽提的总RNA中，95%的RNA是rRNA，2%的RNA是mRNA，剩下的则是lncRNA、microRNA、siRNA等。rRNA整个人类当中是非常保守的，在各个组织器官中也是非常稳定的，因此这些测序结果对我们的研究是没有用处的。mRNA则是RNA中比较重要的部分。

    具体：以人的为例：总RNA跟带有Poly(T)探针的磁珠结合-洗脱结合的mRNA-用Mg离子溶液打碎mRNA-随机引物反转第一条链的cDNA，之后再合成第二条cDNA,获得双链cDNA-对双链cDNA末端修复，加A加接头-片段选择，PCR扩增、纯化（如果样本中存在污染物，则需要结合试剂盒进一步纯化）。

    一般会在测序前对总RNA进行一次质检，根据电泳质检结果中的18S和28S（rRNA）两个峰的高度以及峰的尖度来判断RNA的质量，峰越高越尖（RIN > 8.0）表示RNA的完整度越好。当然，浓度以及A260/A280比值也是需要的。

总RNA提取

    TRIzol™ Reagent是一种完全的即用型试剂，可用于提取高质量的总RNA或者从各种生物样本中同时提取RNA、DNA和蛋白质。这种酚和异硫氰酸胍单相溶液，可用于提取人、动物、植物、酵母或细菌来源的细胞和组织样本中的纯RNA、DNA和蛋白质，只需一个小时即可完成。

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      GENEzol™ Reagent试剂用于高质量总RNA的提取，同时也可提取血液、白膜层、血浆、血清、培养细胞和组织等多种样本中RNA、DNA和蛋白质。GENEzol是一种酚、氯仿和异硫氰酸胍溶液，是总RNA提取经济有效的选择。所提取RNA可直接用于各种下游应用，如cDNA 文库构建，克隆，逆转录PCR，实时PCR，核酸酶保护分析和Northern印迹杂交。

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    RNeasy Mini Kit 试剂盒可从细胞、组织或酵母中快速纯化高品质RNA，硅胶膜RNeasy离心柱的结合能力达100 μg RNA。无需酚/ 氯仿抽提，无需氯化铯梯度离心，无氯化锂或者乙醇沉淀步骤。数分钟内快速纯化得到高品质总RNA，在各种下游应用中表现良好。

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单细胞RNA提取

    ARCTURUS PicoPure RNA 分离试剂盒用于从十个以下细胞甚至单细胞中回收高质量总RNA。

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去DNA

    Ambion Turbo DNA-free kit 除DNA试剂盒能够彻底有效地消化DNA，并去除消化后的酶和二价阳离子。

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去rRNA

    Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Human/Mouse/Rat)试剂用于从人、小鼠、大鼠样本中去除细胞质核糖体RNA。

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     RiboMinus Eukaryote Kit 除核糖体RNA。

细菌mRNA提取

    MICROBExpress™ Kit细菌mRNA富集试剂盒通过从总RNA除去rRNA来提取细菌mRNA。

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PCR产物纯化

    DNA Clean & Concentrator™-5试剂盒用于纯化最高达5μg DNA，DNA可来自PCR，核酸内切酶消化、DNA修饰、同位素/荧光标记等生化反应。洗脱DNA适用于PCR、微阵列、连接和测序等。该产品有助于去除DNA聚合酶、修饰酶、RNA聚合酶、连接酶、激酶、核酸酶、磷酸酶和限制性内切核酸酶，以及游离dNTP及其类似物，包括放射性标记和荧光衍生物。

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磁珠纯化

细胞核分离

    Nuclei EZ Prep细胞核分离试剂盒用于从哺乳动物细胞中快速分离胞核。该试剂盒可从通用细胞类型获得高得率细胞核。适合为染色质、基因组DNA、组蛋白和核RNA/RNP提供细胞核来源，为体外凋亡检测、功能性研究（如细胞转录状态检查）制备细胞核。

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三、文库构建

     建库：去除rRNA之后获得的mRNA进行构建文库，先对mRNA打断再进行反转录的文库构建方法。之后反转的cDNA再末端修复到平末端，加上ployA和接头

四、测序试剂盒

    测序：SE测序-单端测序；PE测序-双端测序；一般现在用的是PE测序。

UID转录组建库试剂盒

• 省时同时构建8个文库仅5小时，时间节省30％
• 省力无需第二链合成等步聚，操作简便
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• 精确测序结果与qPCR结果高度一致

   RNA链特异性建库试剂盒

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