QIAGEN REPLI-g单细胞基因组分析试剂的相关原理

放大原理

REPLI-g Single Cell Kit 使用等温基因组扩增，称为多重置换扩增 (MDA)，它涉及随机六聚体与变性 DNA 的结合，然后在恒温下使用优化形式的 Phi 29 聚合酶进行链置换合成，具有异常强的链置换特性。额外的引发事件发生在作为模板的每条被取代的链上，从而能够产生高产量的扩增 DNA（见图“ 多位移放大（MDA）技术”）。Phi 29 聚合酶是一种噬菌体衍生酶，是一种具有 3’→5′ 引物核酸外切酶活性（校对活性）的DNA 聚合酶，其保真度比Taq DNA 聚合酶高 1000 倍。在独特、优化的 REPLI-g 单细胞缓冲液系统的支持下，Phi 29 聚合酶可轻松解析二级结构，如发夹环，从而防止聚合酶在扩增过程中滑动、停止和解离。这使得生成高达 100 kb 的 DNA 片段而没有序列偏差。

细胞裂解和 DNA 碱变性

基因组 DNA 在用于酶促扩增程序之前必须变性，这通常使用苛刻的方法来完成，例如在高温下孵育（热孵育）或增加 pH 值（化学碱性孵育）。REPLI-g Single Cell Kit 使用温和的碱性孵育，允许细胞裂解和 gDNA 的均匀 DNA 变性，DNA 片段化或无碱基位点的产生非常低。这导致扩增的 DNA 具有非常高的完整性，并使扩增片段的长度，从而使基因组位点和序列均匀呈现。

有效消除可检测的 DNA 污染

所有 REPLI-g Single Cell Kit 组件都经过独特的受控净化程序，以确保消除所有 REPLI-g 可扩增的 DNA 污染。缓冲液和试剂通过创新和标准化的程序暴露在紫外线辐射下，以确保不存在任何可检测的残留污染 DNA（见图“ 创新的去污程序”）。紫外线处理后，试剂盒经过严格的质量控制，以确保功能齐全。