以肝脏细胞为模型的实验越来越受到重视，在肝脏病变机理研究、药物代谢研究、药物毒理评估等方面有广阔的应用前景。然而，以个体原代肝细胞为材料来源会产生如取材困难、材料批间差大、无法长期稳定供应等一系列难以克服的问题。因此，通过iPS批量转化生产肝细胞的方法就显示出特别的优势。Cellartis iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System可以稳定地、规模化地实现iPS向hepatocyte的诱导转化生产，而且诱导转化出的肝细胞能够稳定表达药物代谢相关酶系统和药物转运系统。

人类iPS细胞向肝细胞分化的简单而通用的系统
Cellartis细胞iPS向肝细胞分化系统是一个完整的系统，包括所有培养基、补充剂和将任何iPS细胞系分化为肝细胞的方案(Laydon, Bangham, and Asquith 2015)。该方案模拟体内肝脏发育:iPS细胞首先分化为最终内胚层(DE)细胞，然后进一步分化为成熟肝细胞。分化成熟肝细胞在分化第21天准备好用于您的研究应用，并且具有至少11天的实验时间窗口。

iPS细胞到肝细胞分化系统概述。完整的系统包括培养基、补充物和将任何iPS细胞系分化为肝细胞的方案。

培养效果：

从hiPS细胞系中衍生同质终代内胚层细胞。A. RT-qPCR分析显示，DE细胞中干细胞标志物OCT4 (A1)和NANOG (A2)的表达下调。与未分化的hiPS细胞相比，DE细胞中DE标记物CXCR4 (A3)和SOX17 (A4)的mRNA表达强烈上调。胚胎外标记物SOX7 (A5)的低表达表明胚胎外内胚层细胞极少发生。b组DE标记物SOX17 (B2, B5)和干细胞标记物OCT4 (B3, B6)的免疫细胞化学染色显示，来自hiPS细胞系ChiPSC6b和P11025的DE细胞中存在少量OCT4免疫阳性细胞核，而大多数SOX17免疫阳性细胞核。细胞核用DAPI染色(B1, B4)。

实验方法：
方法
iPS细胞向肝细胞的分化
分化方案由Asplund等人于2016年发布，并对成熟阶段进行了一些修改(Laydon, Bangham, and Asquith 2015)。简单地说，iPS细胞在DEF-CS中以确定的细胞密度在第0天的细胞培养基中培养。在接下来的7天内，培养基变化产生均匀的DE细胞，然后酶解并重新镀上进一步的肝细胞分化。肝细胞分化培养基引导DE细胞在体内经历与肝脏发育相同的发育阶段:腹前肠、肝母细胞、胎儿样肝细胞和成熟肝细胞。这个过程还需要两个星期。在这个过程的最后，提供的肝细胞维持培养基允许功能维持至少11天。

免疫细胞化学
细胞用抗hnf4 α一抗(Santa Cruz Biotechnology)染色，然后用驴抗兔二抗染色，用DAPI反染色(Laydon, Bangham, and Asquith 2015)。将代表性的hnf – α图像与DAPI合并，并对hnf – α-DAPI双阳性核的数量进行评价。

RT-qPCR
使用OCT4 (Hs01654807_s1)、NANOG-1 (Hs02387400_g1)、SOX17(Hs00751752_s1)、CXCR4(Hs00237052_m1)、SOX7(Hs00846731_s1)、CREBBP (Hs00231733_m1)、AFP (Hs00173490_m1)、Albumin (Hs00910225_m1)、CYP1A2 (Hs01070374_m1)、CYP2C9 (Hs004260376_m1)和CYP3A4 (Hs00604506_m1) TaqMan探针(Applied Biosystems)进行分析。使用ΔΔCt方法计算表达水平，归一化为CREBBP表达。

CYP活性测定
细胞用不含酚红的温水水洗两次(Thermo Fisher Scientific)。温式WME中加入26µM非那西丁(CYP1A)、50µM甲苯妥英(CYP2C19)、9µM双氯芬酸(CYP2C9)和3µM咪达唑仑(CYP3A)，并添加0.1% PEST、25 mM HEPES和2 mM l -谷氨酰胺。2h后，收集100µl上清，-80℃保存，待LC/MS分析扑热息痛、羟基甲苯妥英、羟基双氯芬酸和羟基咪达唑仑。用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)定量每孔的蛋白量。代谢物浓度按每孔蛋白量和测定时间归一化。

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Y30055 Cellartis® iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System 1 Kit