BeYaMA^TM 1干细胞无血清培养基实验操作手册：

一、   培养皿包被

1、      4℃溶解Matrigel（BD 354277）过夜，轻摇混匀。请注意：原液应是均质粘稠的半流体状态，要避免温度过高，否则Matrigel会变成凝胶状态。

2、      冰上预冷1.5ml离心管和移液器枪头，冰上快速将Matrigel分装成350-500ul/支，储存于-80℃，用前置于4℃解冻。

3、      将溶解的Matrigel加入25ml预冷的无血清DMEM/F12培养基中，轻轻混匀，避免产生气泡。

4、      将稀释的Matrigel加入六孔板中，1ml/孔，轻摇培养板，使Matrigel均匀铺在培养板底部。

5、      Parafilm封好包被的培养板，置于4℃储存，用前置于37℃培养箱中孵育至少1小时。

二、   培养液准备

1、      在4℃解冻BeYaMA^TM 15X Supplement（货号：HJ0103M）添加剂，加入BeYaMA^TM 1Basal Medium（货号：HJ0102M）基础培养基中，形成500mL BeYaMA^TM 1 Complete Medium（货号：HJ0101M）完全培养基。

2、      BeYaMA^TM 1完全培养基可在4℃稳定储存2周。可按实际用量将BeYaMA^TM 1完全培养基分装后置于-80或-20℃保存，避免反复冻融。

三、   hESCs/hiPSCs复苏

1、      复苏hESCs/hiPSCs前，复温Matrigel包被的培养板，吸弃孔内液体，加入2ml BeYaMA^TM 1完全培养液及2ul 5uM/L Rock Inhibitor Y27632，用以促进细胞贴壁。

2、      从液氮罐中取出hESCs/hiPSCs冻存管，浸入37℃水浴，轻轻摇晃，直到细胞融化至仅剩一小块冰晶，迅速取出并用75%酒精擦拭冻存管外表面，转移至无菌超净台中。

3、      将细胞悬液接种至准备好的培养板中，轻轻晃动使细胞均匀分布在板底。

4、      小心将培养板放置于培养箱中，避免振动。

5、      30-90min后显微镜下观察细胞基本贴壁，更换新鲜BeYaMA^TM 1完全培养液，之后每24h换液，4-6天后传代。

四、   hESCs/hiPSCs传代

1、    提前准备好Matrigel（BD 354277）包被过的六孔板，吸弃孔内包被液，加入2ml BeYaMA^TM 1完全培养液。

2、    吸弃待传代hESCs/hiPSCs孔内的培养液，并用1ml无钙镁的PBS洗1遍。

3、    加入0.5ml Accutase细胞分离液使之完全覆盖皿底。

4、    室温孵育5-8分钟或37℃孵育3-5分钟，显微镜下观察到大部分克隆细胞间出现间隙，细胞表面发亮但尚未相互分离时，可吸去Accutase。

5、    可将培养板放置37℃继续孵育1min,或者直接加入适量新鲜BeYaMA^TM 1完全培养液，轻轻摇晃，干细胞集落基本脱落。亦可用细胞刮刀将剩余克隆轻轻刮下，尽量避免用枪头反复吹打细胞。

6、    将制备好的细胞悬液按1：3 – 1：6的比例接种至准备好的培养板中，注意细胞过密则克隆边界不圆滑，易分化，细胞过稀则克隆存活率降低。

7、    轻轻摇晃培养板让细胞均匀分散，置于37℃，5% CO²培养箱中培养过夜。

8、    每天更换培养液，待细胞密度达到80%以上，或者克隆中央密度过大，影响细胞生长时进行传代。

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