经典的病原学检测方法主要包括细菌（真菌）培养、镜检和抗体检查，以及基于PCR的病原特异核酸检测，这些方法在神经感染性疾病诊断中取得了很大的进展，但在总体上其诊断灵敏度仍较低，时效性差，病原体鉴定信息和耐药信息不全面，且对于未知或少见、罕见的病原微生物，无法进行识别。因此，临床诊断神经感染性疾病的难度很大。

在二十一世纪初，以多重PCR为基础的技术在感染性疾病病原学检测中取得了很大的进步。美国的GeneXpert快速检测系统和法国的Film Array分子诊断系统均实现了感染性疾病责任病原的高通量检测，但其一次最多只能检测10余种病原微生物。目前已知可引起脑炎的病毒就超过100种，且病原体种类正在不断增长，故目前的病原体检测方法尚不能有效涵盖临床感染性疾病的病原谱。

二代测序技术（next generation sequencing，NGS）又称为下一代测序技术和高通量测序，其可一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，是一组较一代测序通量更高、成本更低、用时更短且自动化程度更高的测序技术。因其可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。

从2010年开始，采用NGS检测诊断感染性疾病开始逐渐从国家实验室、疾控中心过渡到临床。最早使用的NGS平台为2005年发布的GS20测序仪，与之前基于Sanger测序原理的测序仪器相比，其获得的微生物基因组数据量提高了百倍。从此之后，各家公司也分别推出了其各自的基于NGS的检测仪器。

随着NGS诊断神经感染性疾病的研究越来越多，从2013年以前每年发表1-2篇研究报道，发展到2014年的6篇、2015年的13篇，目前NGS已经成为临床神经感染性疾病诊断的有效工具之一。

神经感染性疾病在临床上主要表现为脑炎和脑膜炎，也可表现为脑脓肿（硬膜外、硬膜下、脑实质）及脑肉芽肿等。神经感染性疾病确诊的依据在于从脑实质或脑脊液内检测到病原生物的存在，而引起神经感染的病原生物主要包括病毒、细菌、真菌、寄生虫、螺旋体、立克次氏体等。由于血脑屏障的存在，在血清内难以检测到有效的病原体信息，只有在脑脊液甚至脑实质内才能检测到，而脑脊液取材相对困难、标本量小，均限制了神经感染性疾病病原体的检出。

近几年来，由于新发病原体感染[重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒]的不断涌现，耐药细菌不断出现，以及器官移植或免疫性疾病治疗后各种条件致病菌的感染，感染性疾病再次回到临床医师的视野中。但感染性疾病的病原种类繁多，传统的免疫学检测及病原微生物培养等手段，在鉴定感染性疾病的病原方面耗时、费力，难以及时地为临床提供可靠的诊断依据，使不少感染性疾病患者未能得到及时、有效的治疗，导致其预后不良。

2014年，加州大学CharlesY.Chiu团队在《新英格兰医学杂志》报道了世界第一例通过NGS检测诊断的神经感染病例。一位反复头痛、发热接近1年的患者，在进行了38种不同的诊断试验（从血清学到培养和活检），仍然无法明确其致病病原体，并进入了昏迷状态，而最终使用NGS检测明确其为钩端螺旋体感染后，给予针对性的青霉素治疗，最终患者转危为安。

此后，多个高质量的个案报道和临床研究已经表明，NGS有潜力成为神经感染性疾病的诊断工具。对于并非临床常见而没有在多数医院常规开展检测的囊虫、布氏杆菌、螺旋体等病原体，或者培养方法较复杂或非常规开展的李斯特菌、奴卡菌等病原体，NGS检测可以规避常规检查的不足。

总体上，目前估计有30%-60%的脑炎病例即使经过全面深入的检查，仍然无法明确其病因。使用NGS检测可诊断病毒性（DNA病毒和RNA病毒）脑炎。使用DNAse可以通过降低人源化核酸的背景，从而显著提高病原微生物的检出率（30-50倍）。最关键的是，使用NGS检测时，可以在完全没有先验信息或者临床倾向性的时候检测到病原，因此可对于少见、罕见感染或者新发的感染性病原体进行检测。

除了这些已知感染人类的病原体以外，基于宏基因组的NGS检测，还可识别一些此前未知的可以引起人类疾病的病原体。

如2015年，德国报道了3例基底节脑炎患者，通过NGS在脑内检测到松鼠博尔纳病毒，患者临床上以基底节病变为主，发病急骤，死亡率高，这是第一次发现松鼠博尔纳病毒传染人类的证据。

2015年，日本Sakiyama等报道了4例表现为脑脊髓膜炎的渔民，常规检查包括活检都未能明确其致病病原体，而通过NGS检测发现其是感染了以前从未曾报道的属于古细菌域的嗜盐菌（Halobacterium），在给予复方磺胺甲恶唑治疗后患者完全好转。上述报道均表明，NGS检测可以诊断出一些罕见的、新发的或者不典型的病原微生物，如钩端螺旋体、星状病毒、古细菌、博尔纳病毒等，从而深化人们对神经感染性疾病的认识。

2016年，西京医院赵钢教授团队领衔获得了科技部“组学特征谱在脑膜炎病原学诊断中的应用”的重大专项研究成果，拉开了国内NGS技术在神经感染领域的使用。此后，协和医院关鸿志教授和华大基因联合进行了中枢神经感染脑脊液NGS检测的系列研究，已经先后报道了疱疹病毒、李斯特菌、布氏杆菌等相关病原体引起的中枢神经系统感染。

2017年，复旦大学华山医院感染科张文宏教授团队，应用NGS技术在1例眼内炎患者的玻璃体液中检测到伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV），首次证实PRV可以感染人类，并引起眼内炎。最近，由北京协和医院神经科关鸿志教授牵头的多中心脑炎协作组，使用NGS技术在世界上首次报道了PRV导致人类脑炎的病例。我国在使用NGS诊断神经感染的技术进展上基本与世界同步。

尽管脑脊液NGS检测给神经感染的病原学检查带来了很大变革，但目前NGS的检测和解读仍然存在着很多问题。不同于NGS检测在遗传性疾病中的应用，感染性疾病待测标本的成分复杂、病原微生物核酸水平较低等因素均制约了脑脊液病原微生物的NGS检测。

一、灵敏度有待提高

首先存在的问题是灵敏度，尽管NGS检测在诊断少见、罕见病原体方面展现了优于传统方法的巨大实力，但对于常见的结核分枝杆菌、隐球菌等病原体，其灵敏度并不强于传统方法。对于这些常见病原体，反倒经常是传统方法检测不到，NGS检测也查不到；而即使传统方法检测到这些病原体，NGS仍然可能检测不到或只检测到极少量特异的片段，难以确定其准确性。

例如对结核分枝杆菌的宏基因组检测，目前最优的方案仍然是在MGIT960液体培养的基础上再进行NGS测序。究其原因，可能在于常见病原体的致病力较强，仅需少量病原体即可致病，而对少量病原体的检测，NGS并不优于传统的培养和PCR检测。

另一方面，结核分枝杆菌可以是胞内菌，而目前的检测方法主要是用脑脊液上清进行检测，就有可能漏掉胞内感染的结核分枝杆菌；而结核分枝杆菌由于核酸中GC含量比较高（超高60%），多数细菌的解链方法不能充分将结核分枝杆菌的核酸链解开，因此在适合多数病原微生物的标本处理条件下，并不能有效地达到检测结核分枝杆菌的效果。

故对部分抗酸染色或GeneXpert检测结果阳性确诊的结核性脑膜炎患者，NGS仍然只能在其脑脊液内检测到少量或根本没有检测到结核分枝杆菌的片段。目前对临床标本直接进行NGS检测来诊断结核分枝杆菌感染难度很大，而作为替代，往往是将临床标本进行结核培养后再进行NGS检测，以此提高临床标本检测的阳性率。

除了病原体的载量和特性的因素外，对于一些存在机体免疫反应进而引起损害的感染性（后）脑炎，如乙型脑炎，主要依靠血清学检查检测患者体内的乙型脑炎病毒抗体来诊断，即使最灵敏的RT-PCR检测也只能在10%患者脑脊液内检出其核酸片段，故对于这些患者，NGS检测的诊断意义有限，抗体检测可能是其更为有效的临床诊断方法。

因此，NGS虽然是高通量检查，并理论上可以检测几乎所有病原微生物，但并不能完全替代临床所有的病原体检测方法。这要求我们一方面继续优化NGS的检测方法，使其可以尽可能多地覆盖病原体的范围和提高检出率，另一方面又要了解NGS技术的局限性，从而在进行NGS检测的同时，要保留或探索其他有效的病原体检测方法作为补充或验证。

对于部分颅内脓肿或肉芽肿患者，由于其病灶局限于脑实质，释放到脑脊液中的病原体含量有限，因此对于这些疾病，只有对组织标本进行NGS检测才可能测得病原体。而脑组织与脑脊液在组成上差异很大，因此NGS检测的样品背景和组成都会影响到检测结果。然而由于脑组织取材困难，目前对脑组织病原微生物的NGS检测探索还比较少。

二、脑脊液NGS病原体检测的诊断特异度较低

特异度较差是制约NGS临床应用的另一个主要问题，在NGS报告中经常可以看到不致病病原体、不相关病原体、不明确病原体。与胃肠道、呼吸道不同，由于血脑屏障的存在，曾经研究者认为脑内不存在微生物，因此只要脑脊液内检测到细菌或病毒即意味着神经系统感染的存在，对于既往的染色、培养等技术，这一原则均能成立。

但随着NGS技术的出现，在脑脊液内可检测到很多不同物种的片段。标本里经常可以检测到多种无法解释的病原微生物的特异读长，其部分原因可能在于标本、试剂的污染，如环境微生物混杂其中（如植物、植物病毒等），难以判别。对于这些污染，需要通过实验室质控和标本间数据的比对进行排除。

因此，为了明确诊断，对于NGS检测到的病原体信息往往需要使用传统方法进行验证，如关鸿志教授所诊断的PRV脑炎患者，均由中国农业大学韩军研究员团队对标本进行血清学检测予已确诊。针对未来复杂的临床样本如血液、拭子、粪便等，数字PCR联合NGS技术可以提高检测目标序列的灵敏度，以协助感染性疾病诊断。

多个实验室的报告也发现，脑脊液NGS测序中存在着一些较为常见的细菌成分，如丙酸痤疮杆菌、伯克霍尔德菌和不动杆菌等。健康人或患者的脑组织和脑脊液内是否会存在一个类似于低载量肠道菌群的微生物构成，值得探索。

尤其是最近研究发现，在非神经感染性疾病如阿尔茨海默病或肌萎缩侧索硬化患者的脑脊液和脑实质内，可检测到真菌、细菌或病毒的核酸片段和特异蛋白成分，提示病原微生物是神经变性病潜在的触发因素可能，但其临床意义目前尚未完全明确，而其是否能成为最终的治疗靶点还有待探索。借助于NGS技术，将可能重新认识病原微生物与神经系统的相互作用模式和意义。

NGS技术在感染性疾病的诊断中具有极大的潜在价值，但也仍然有很大的局限性。目前已经报道的NGS辅助诊断神经感染的研究多为病例报道，多数情况下只能检测到可疑的病原微生物特异读长，即高通量测序时，读出每一个片段的序列信息，而作为临床诊断依据还缺乏明确的标准，往往还需要通过经典病原学方法或临床治疗效果对其进行评估。因此，在临床上使用NGS诊断神经感染性疾病，需要在优化NGS检查方法的同时，继续完善NGS的验证和解读。

一、NGS检测结果的解读——脑内责任病原体的鉴定和微生物菌群的意义分析

NGS检测诊断中枢神经感染的核心是对责任病原体的识别。由于NGS检测往往可以得到大量背景或者无关微生物片段，从中寻找或识别责任病原极为关键。目前常用的方法包括以下几种。

1. 建立责任病原列表：对已报道的可致人类中枢神经系统感染的细菌、真菌、病毒等微生物建立列表，一旦在NGS检测中出现该致病病原体的片段，即认定为是致病病原体。这种方法对于致病性强或人类极少接触的病原体，如布氏杆菌、钩端螺旋体等病原体的诊断意义较大，而对于在机体中存在潜伏感染的病毒或者条件致病菌，因为不能区分其为现症感染还是潜伏感染，而需要慎重判断。

2. 建立脑脊液常见微生物数据库：对于各实验室、检测单位在NGS检测中常见的背景微生物建立数据库，记录其检测到的常见片段数目。一旦在临床标本NGS检测中出现不属于常见背景菌范围的可疑病原体片段，或某种微生物的所检片段数目明显超过背景微生物数据库中的数据，则将其列入可疑的责任病原体，并进一步用其他方法进行验证。该策略尤其适合病毒感染引起的脑炎，如单纯疱疹病毒感染患者脑脊液内可以检测到绝对和相对数量都极高的单纯疱疹病毒片段。

3. 脑脊液微生物菌群的意义：肠道菌群对神经系统的影响目前已得到广泛认可，但脑内是否存在着一个类似的微生物菌群，目前还存在争议。目前的测序结果在检测到可疑病原的同时，往往会检测到很多“不相干”微生物的片段，传统观点认为其是系统污染或实验室污染导致，而不予关注。但多个实验室的报告也发现，存在着一些较为常见的细菌成分的组成，如丙酸痤疮杆菌、根瘤菌等。

健康人或者患者的脑组织和脑脊液内是否可能存在一个类似于肠道菌群的微生物构成，值得探讨。在非神经感染性疾病如AD或ALS患者脑脊液和脑实质内可检测到真菌、细菌或病毒的核酸片段和特异蛋白成分，但其临床意义目前尚未完全明确。借助于NGS技术，可为探索神经变性病和神经感染的关系提供线索和依据。

二、NGS检测结果的验证——建立完整快速的神经感染性疾病诊断体系

尽管NGS检测在诊断神经感染性疾病病原时经常给出意想不到的病原体信息，但通常只有不到1/3的待检标本可以检测到明确的病原体信息。即使在脑脊液中通过NGS检测到可能的责任细菌、真菌或病毒片段，其占总片段的比例也经常极低，甚至只有数个片段，难以作为确诊依据。因此，NGS检测在中枢神经系统感染诊断中往往只具有提示意义，而在检测到非临床常规筛查的病原体时，需要进一步使用经典的病原体检测方法进行确诊。

如在非疫区，NGS检测往往可以出人意料地检出散发的中枢神经系统布氏杆菌染，而最终都必须通过布氏杆菌的抗体检查予以验证。这就需要在临床上发展完善的病原体验证检测体系，尤其是对于一些常见方法不易检测到的病原微生物，如奴卡菌和厌氧菌因为不易培养，常规培养阳性率极低，当NGS检测有相关病原片段被查到时，可以有针对性地调整脑脊液培养的方案，以提高相关病原培养的阳性率。

由于目前的NGS检测成本仍然较高，还不能在临床广泛普及，也影响到其时效性。因此，对于一些发病急骤、进展迅速的急性中枢神经感染患者，需进一步发展即时的病原体检测；而对于NGS检测灵敏度较低的病原体，建立较为完备的诊断方法库具有重要价值。

NGS也只是一种病原检测方法，所以同样存在其监测的盲点和误区，对NGS检测结果不切实际的期待、依赖和解读，不仅推高了临床检测成本，且使有效检查无法顺利开展，从而同样带来误诊和漏诊。

因此，尽管Brown等建议将NGS作为脑炎病原学诊断的常规方法开展，但同时仍然要将单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒和肠道病毒等常见病毒的PCR检测放在一线检查行列。

三、NGS检测方法的优化——根据可能的责任病原体类型选择最优测序方案

目前临床推出的NGS病原体检测多数仍采用通用的标本处理和测序方案，其在未了解临床具体病历资料的情况下进行检测，虽然方便了送检流程，并降低了检测成本，但由于不同标本和病原微生物（细菌、真菌、病毒、寄生虫等）在测序时所需的最优处理条件和生物信息分析不同，导致目前并不能让一种NGS检测流程适合于所有的感染性病原体。

这就需要在下一步的测序研究中，根据患者的病史和临床检查推测可能的病原体，有针对性地进行标本预处理后再测序，甚至对于测序结果的生信分析采用不同的策略，以期在适度兼顾各种未知病原体的同时，提高特殊病原体的检出率。

除此之外，目前仅以检测到的病原体Reads作为诊断依据的方法误差较大，需要设定一定的标准和流程来确定检测到的病原体是否为责任病原体，并根据不同类型病原体设计针对性的随机双盲试验，来评估测序方法的有效性。

随着测序技术的进展和成本的下降，NGS技术在临床的应用日益广泛，美国食品药品监督管理局建议对特定的待检样本进行NGS检测时，可以探索合适的步骤做成一个系统，从而最大程度地优化责任病原微生物的检出。

下一步，NGS技术的研发重点是如何对特定标本和可能病原体，在已有的检测系统基础上进行优化，从而提高责任病原体检出的灵敏度和特异度。

此外，还应重视的是，由于NGS检测范围和深度显著超出传统方法，因此对其检测结果的评估与传统微生物检测方法的效果评估不同，需要发展新的NGS检测特异度和灵敏度评估策略，才能为将来NGS检测的应用打下坚实基础。

来源：诊断学理论与实践  2018年7月第17卷第4期

作者：冯国栋 贺旻 汪昕（复旦大学附属中山医院神经内科）